准备工作

每次操作前都要记得提前灭菌，如
1.播种前，准备灭菌水，配套的M0盒子，枪头，离心管，培养皿灭菌时，橡皮筋绕三圈，150ml瓶子配100ml，不宜过多
2.摇菌前，准备灭菌20mlPU瓶，滤纸，M1,DM,枪头，培养皿，LB

第一阶段：灭菌，播种

1. 2ml离心管装40粒种子，加75%酒精，盖盖翻转，浸泡1min，种子多可用更大容器

2. 用移液器吸掉酒精，加入适量50%的84消毒液，盖盖翻转，浸泡3-5min（种子污染重可适当延长）

3. 吸掉消毒液，加入无菌水洗5遍，，1min颠倒20次，保持离心管内无菌

4. 用灭菌镊子将灭菌种子播种到M0

5. 黑暗培养5天左右

第二阶段，摇菌

（提早准备需要的灭菌物品：20ml玻璃瓶）

1. 播种第五天后摇菌，准备好菌液，冰盒，LB，玻璃瓶，枪头，枪

2. 播种5天后用液体LB培养目标细菌，20ml玻璃瓶：4ml抗性LB+10微升目标农杆菌，于28度摇床中培养约14-16h

3. 注意。农杆菌在培养液中繁殖速度与其活性有关，在对数期活性最好，最能侵染植物，所以要严格计算接种时间，可以间隔2h重复摇菌，如pm6:00,pm8:00摇菌，次日8:00挑选合适浓度，防治浓度过高。摇菌钱要挑选阳性单克隆菌落，在抗性平板上接种细菌，28度培养48h，阳性目标细菌会在平板上长单菌落，此时用10微升枪头吸取单菌落在培养液中反复吸打几次，菌就可以生长了。
   （1个PU瓶-接种1个单皿-转到2-3个方盒）

第三阶段，外植体制备和侵染

1. 第六天或第七天 外植体的制备及侵染

2. 准备好共培养培养基M1,培养基快冷时加入乙酰丁香酮（AS)（100ml加100微升）备用

3. 分光光度计测菌液OD值,LB中0.4左右最好（0.2-0.5可以），一般摇菌12-14h。

4. 准备菌液，吸2ml培养好的菌液到无菌离心管中，6000rpm3min。离心弃掉上清，再加2mlDM(AS+)悬浮，放4度冰箱备用(DM是M4不加琼脂粉)

5. 在无菌平皿中加入18mlDM(AS+)，用无菌剪刀剪取下胚轴到平皿中，每个0.8-1cm，每皿150-200个。（切时一刀垂直切下）（约2-3个方盒）

6. 在切好的外植体中导入刚才准备的2mlDM菌液，用无菌镊子轻轻家去外植体到无菌滤纸上放置片刻（晾干农杆菌，防止侵染过度），目的是吸走外植体表面多余的菌液，然后再将外植体转到M1培养基中，暗光下24度培养，

第四阶段，转M2

1.暗光下共培养36-48h后转到M2中，光下正常培养（24度白天，16hs、8hs晚上）
（1瓶M1可以倒-23-24皿，1瓶M2可以倒-13皿）

第五阶段，转M3

1. 约第28天，将外植体转移到M3中，每2-3周继代一次，直到出现绿芽（紫）最后将有完整生长点的绿芽转入M4培养基
2. 约2次M3后会有较多绿芽，M4上生根需要20天
3. 总计大概3个月