Java教程

组织培养学习

本文主要是介绍组织培养学习,对大家解决编程问题具有一定的参考价值,需要的程序猿们随着小编来一起学习吧!

准备工作

每次操作前都要记得提前灭菌,如
1.播种前,准备灭菌水,配套的M0盒子,枪头,离心管,培养皿灭菌时,橡皮筋绕三圈,150ml瓶子配100ml,不宜过多
2.摇菌前,准备灭菌20mlPU瓶,滤纸,M1,DM,枪头,培养皿,LB

第一阶段:灭菌,播种

  1. 2ml离心管装40粒种子,加75%酒精,盖盖翻转,浸泡1min,种子多可用更大容器

  2. 用移液器吸掉酒精,加入适量50%的84消毒液,盖盖翻转,浸泡3-5min(种子污染重可适当延长)

  3. 吸掉消毒液,加入无菌水洗5遍,,1min颠倒20次,保持离心管内无菌

  4. 用灭菌镊子将灭菌种子播种到M0

  5. 黑暗培养5天左右

第二阶段,摇菌

(提早准备需要的灭菌物品:20ml玻璃瓶)

  1. 播种第五天后摇菌,准备好菌液,冰盒,LB,玻璃瓶,枪头,枪

  2. 播种5天后用液体LB培养目标细菌,20ml玻璃瓶:4ml抗性LB+10微升目标农杆菌,于28度摇床中培养约14-16h

  3. 注意。农杆菌在培养液中繁殖速度与其活性有关,在对数期活性最好,最能侵染植物,所以要严格计算接种时间,可以间隔2h重复摇菌,如pm6:00,pm8:00摇菌,次日8:00挑选合适浓度,防治浓度过高。摇菌钱要挑选阳性单克隆菌落,在抗性平板上接种细菌,28度培养48h,阳性目标细菌会在平板上长单菌落,此时用10微升枪头吸取单菌落在培养液中反复吸打几次,菌就可以生长了。
    (1个PU瓶-接种1个单皿-转到2-3个方盒)

第三阶段,外植体制备和侵染

  1. 第六天或第七天 外植体的制备及侵染

  2. 准备好共培养培养基M1,培养基快冷时加入乙酰丁香酮(AS)(100ml加100微升)备用

  3. 分光光度计测菌液OD值,LB中0.4左右最好(0.2-0.5可以),一般摇菌12-14h。

  4. 准备菌液,吸2ml培养好的菌液到无菌离心管中,6000rpm3min。离心弃掉上清,再加2mlDM(AS+)悬浮,放4度冰箱备用(DM是M4不加琼脂粉)

  5. 在无菌平皿中加入18mlDM(AS+),用无菌剪刀剪取下胚轴到平皿中,每个0.8-1cm,每皿150-200个。(切时一刀垂直切下)(约2-3个方盒)

  6. 在切好的外植体中导入刚才准备的2mlDM菌液,用无菌镊子轻轻家去外植体到无菌滤纸上放置片刻(晾干农杆菌,防止侵染过度),目的是吸走外植体表面多余的菌液,然后再将外植体转到M1培养基中,暗光下24度培养,

第四阶段,转M2

1.暗光下共培养36-48h后转到M2中,光下正常培养(24度白天,16hs、8hs晚上)
(1瓶M1可以倒-23-24皿,1瓶M2可以倒-13皿)

第五阶段,转M3

  1. 约第28天,将外植体转移到M3中,每2-3周继代一次,直到出现绿芽(紫)最后将有完整生长点的绿芽转入M4培养基
  2. 约2次M3后会有较多绿芽,M4上生根需要20天
  3. 总计大概3个月
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